این شماتیک، مفهوم برش‌نگاری الکترونی را نشان می‌دهد. یک نمونه در زیر میکروسکوپ الکترونی قرار گرفته و در زوایای مختلف کج میشود. این کار منجر به ایجاد یک "سری-کج" از تصاویر دوبعدی میشود (قسمت بالا). سپس، این سری-کج با استفاده از پردازش کامپیوتری به یک توموگرام سه بعدی بازسازی می‌گردد (قسمت پایین).
برش‌نگاری الکترونی کرایو (CryoET یا به اختصار: Cryogenic electron tomography) یک تکنیک تصویربرداری است که برای بازسازی ساختارهای سه‌بعدی با وضوح بالا (در حدود 1 تا 4 نانومتر) از نمونه‌ها استفاده میشود. کاربرد اصلی این روش، اما نه محدود به آن، مطالعه درشت‌مولکول‌ها و سلول‌های زیستی است.[۱][۲] CryoET در واقع نوعی پیشرفته و تخصصی از میکروسکوپ CryoET به حساب می‌آید. در این روش، از نمونه‌ها در حینی که کج می‌شوند (فیلمبرداری می‌شوند)، تصویربرداری می‌گردد. این فرآیند منجر به تولید یک سری تصاویر دوبعدی میشود که می‌توان آن‌ها را برای تولید یک بازسازی سه‌بعدی ترکیب کرد؛ مشابه مکانیسمی که در سی‌تی‌اسکن بدن انسان به کار می‌رود. این است که نمونه‌ها در CryoET در مقایسه با سایر تکنیک‌های توموگرافی الکترون، ویژگی متمایز شرایط سرمایشی بسیار عمیق (دمای کمتر از -150 درجه سانتیگراد) تصویربرداری می‌شوند. برای مواد سلولی، ساختار در حالت غیربلوری تثبیت میشود.این امر امکان تصویربرداری از نمونه‌ها را بدون نیاز به خشک کردن یا تثبیت شیمیایی فراهم می‌کند؛ فرآیندهایی که در غیر این صورت باعث تخریب یا تغییر شکل ساختارهای زیستی می‌شدند.[۳][۴]
در میکروسکوپ الکترونی، نمونه‌ها در شرایط خلأ بالا تصویربرداری می‌شوند. چنین محیط خلأئی با نمونه‌های زیستی مانند سلول‌ها ناسازگار است؛ چرا که در این شرایط، آب موجود در نمونه تبخیر میشود و اختلاف فشار ایجاد‌شده باعث ترکیدن سلول می‌گردد. به همین دلیل، در روش‌های متعارف میکروسکوپ الکترونی در دمای اتاق، نمونه‌ها با استفاده از تثبیت شیمیایی (فیکساسیون) و آب‌زدایی (دهیدراته کردن) آماده سازی می‌شوند. با این حال، یک راهکار جایگزین برای تثبیت نمونه‌های زیستی، منجمد کردن سریع آن‌ها است که پایۀ CryoEM یا به اختصار: (Cryo-electron microscopy) روشی به نام میکروسکوپ الکترونی کرایو می‌باشد. در روش برش‌نگاری الکترونی کرایو - همانند سایر روش‌های میکروسکوپ الکترونی کرایو - نمونه‌ها (که معمولا سلول‌های کوچکی مانند باکتری‌ها، آرکی‌ها یا ویروس‌ها هستند) در محیط آبی معمولی آماده شده و روی یک شبکه مخصوص میکروسکوپ الکترونی قرار می‌گیرند. سپس این شبکه به سرعت درون یک مایع سردکننده (مانند اتان مایع) فروبرده میشود. اتان مایع به دلیل ظرفیت گرمایی ویژۀ بالا، حرارت آب را به‌سرعت می‌گیرد. این عمل به‌قدری سریع انجام می‌گردد که مولکول‌های آب فرصتی برای آرایش یافتن یک ساختار بلوری منظم ندارند. حالت آبی که در نتیجۀ این انجماد فوق‌سریع ایجاد میشود، یخ آمورف با چگالی کم نامیده میشود که عموما به دلیل ماهیت شیشه‌ای آن، به آن یخ شیشه‌ای می‌گویند. این شکل از یخ، باعث حفظ ساختارهای طبیعی سلول (مانند غشاهای لیپیدی) میشود؛ ساختارهایی که در صورت انجماد کندتر و تشکیل بلورهای شش‌ضلعی یخ، تخریب می‌شدند. نمونه‌های منجمدشده به این روش، در ادامه و در طول مراحل ذخیره‌سازی و تصویربرداری، در دمای نیتروژن مایع (-196 درجه سلسیوس) نگهداری می‌شوند تا هرگز به دمایی گرم‌تر که امکان تبلور یخ را فراهم کند، نرسند.
روش تصویربرداری و بازسازی سه‌بعدی
در این روش، نمونه‌ها با استفاده از میکزوسکوپ الکترونی عبوری (EM) تصویربرداری می‌شوند. فرآیند کار به این شرح است:
تصویربرداری از زوایای مختلف: نمونه به تدریج نسبت به پرتو الکترونی چرخانده میشود و در هر زاویه (از -60 درجه تا +60 درجه با گام‌های 2 تا 3 درجه) یک تصویر ثبت می‌گردد.
تشکیل سری تصاویر: این مجموعه تصاویر که به سری-کج معروف است، در واقع نماهای دوبعدی مختلفی از نمونه را ثبت می‌کند.[۵]
بازسازی سه‌بعدی: در مرحله نهایی، با استفاده از پردازش کامپیوتری، این تصاویر دوبعدی برای تولید یک مدل سه‌بعدی کامل از نمونه ترکیب می‌شوند.[۶] به این مدل سه‌بعدی نهایی توموگرام گفته میشود که امکان بررسی دقیق ساختار داخلی نمونه را فراهم می‌آورد.
پتانسیل تصویربرداری با وضوح بالا در شرایط درون‌تنی
یکی از مهم‌ترین مزایای برش‌نگاری الکترونی کرایو - که اغلب به آن اشاره میشود - توانایی بازسازی سه‌بعدی تک‌تک اجسام (مانند پروتئین‌ها یا سلول‌ها) است، بدون آنکه نیاز باشد نمونه‌های متعددی از آن شیء - مانند آنچه در روش‌های بلورنگاری یا دیگر روش‌های تصویربرداری کرایوئی‌م (CryoEM) مانند "تک‌ذره آنالیز" ضروری است - موجود باشد.[۷] کرایوئی‌تی (CryoET) زمانی که روی یک سلول دست‌نخورده یا یک سیستم زیستی دیگر به کار رود، یک روش <درون موقعیتی> محسوب میشود؛ زیرا انجماد سریع نمونه‌های به اندازه کافی نازک، آن را به‌قدری سریع در جای خود ثابت می‌کند که تغییرات ایجاد‌شده در موقعیت‌های اتمی به حداقل ممکن می‌رسد.[۸] برای نمونه‌های ضخیم‌تر از حدود 500 نانومتر، شرایط کافی مانند استفاده از فشار بالا لازم است تا امکان تشکیل یخ شیشه‌ای در سرتاسر نمونه فراهم شود.
ملاحظات
ضخامت نمونه‌ها
از آنجا که الکترون‌ها برهم‌کنش شدیدی با ماده دارند، در میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) نمونه‌ها باید بسیار نازک باشند تا به دلیل پراکندگی‌های پیاپی الاستیک، تیره‌شدن تصویر رخ ندهد. به همین دلیل، نمونه‌ها در روش برش‌نگاری الکترونی کرایو عموما ضخامتی کمتر از حدود 500 نانومتر دارند و اغلب مطالعات در این زمینه بر روی موارد زیر متمرکز شده‌اند:
(a) یک برش توموگرافی از واحد انقباضی ماهیچه قلب (سارکومر قلبی). نوار مقیاس: 50 نانومتر. (b) رشته‌های بازسازی‌شده که درون یک توموگرام نقشه‌گذاری شده‌اند. نوار مقیاس: 50 نانومتر. (c) ساهتار رشته کلفت از نوار C تا ناحیه M.ساختارهای پروتئینی بزرگی که در آزمایشگاه خالص‌سازی شده‌اند. برای نمونه، از فناوری برش‌نگاری الکترونی کرایو برای بررسی چگونگی محصورشدن نانوذرات پروتئینی قفسه‌ای 12 نانومتری درون نانوذرات ویروس مانند 60 نانومتری استفاده شده است.[۹]
آماده‌سازی نمونه های بزرگ‌تر
سلول‌های بزرگ‌تر و حتی بافت‌ها را نیز می‌توان با استفاده از روش‌های نازک‌سازی برای تصویربرداری CryoET آماده کرد:
برش‌دهی کرایو: در این روش، بلوک‌های منجمد سلول‌ها یا بافت‌ها با استفاده از یک میکروتوم کرایو به نمونه‌های نازک برش داده می‌شوند.[۱۰]
تراش با پرتو یونی متمرکز: در این روش، نمونه‌های منجمدشده در معرض یک پرتو متمرکز یونی (معمولا گالیم) قرار می‌گیرند که به طور دقیق مواد را از بالا و پایین نمونه می‌تراشند و یک لایه نازک مناسب برای تصویربرداری بر جای می‌گذارند.[۱۱]
نسبت سیگنال به نویز و افزایش وضوح
برای ساختارهایی که در چندین نسخه (کپی) در یک یا چند توموگرام وجود دارند، می‌توان با استفاده از روش <میانگین‌گیری از زیرتوموگرام‌ها> به وضوح بالاتر (حتی تا 1 نانومتر یا بهتر) دست یافت.[۱۲][۱۳] این روش مشابه روش "تک‌ذره آنالیز" عمل می‌کند. در این فرآیند، تصاویر کامپیوتری اشیاء یکسان و هم‌شکل، با یکدیگر ترکیب و میانگین‌گیری می‌شوند. هدف اصلی از این کار، افزایش نسبت سیگنال به نویز است.
محدودیت‌ها
آسیب پرتویی
میکروسکوپ الکترونی به دلیل آسیب پرتویی، نمونه‌های زیستی را با سرعت بسیار بیشتری نسبت به سایر نمونه‌ها تخریب می‌کند.[۱۴] در سایر روش‌های مبتنی بر میکروسکوپ الکترونی، معمولا با ترکیب سیگنال‌های دریافتی از کپی‌های متعدد نمونه (مانند بلورنگاری یا تک‌ذره آنالیز) بر این مشکل غلبه می‌کنند. در روش برش‌نگاری الکترونی کرایو، برخلاف دیگر روش‌ها، به جای تصویربرداری از نسخه‌های متعدد یک نمونه، تعداد زیادی عکس از یک ناحیۀ مشخص و واحد گرفته میشود. این رویکرد باعث میشود که میزان تابش الکترونی (تعداد الکترون‌های برخوردکننده به هر واحد سطح) در این روش، حدود 2 تا 5 برابر بیشتر از روش متداول "تک‌ذره آنالیز" باشد.[۱۵] به طور خلاصه، تصویربرداری کرایوئی‌تی از مواد غیربیولوژیکی با وضوح به مراتب بالاتری نسبت به نمونه‌های زیستی انجام میشود. این موضوع نشان می‌دهد که مهم‌ترین محدودیت در همین مسئله، آسیب پرتویی است.[۱۶]
وضوح عمقی
برهم‌کنش شدید الکترون‌ها با ماده، یک محدودیت دیگر هم ایجاد می‌کند. هنگامی که نمونه را زیر میکروسکوپ می‌چرخانیم، در زوایای بالاتر، پرتو الکترونی باید ضخامت بیشتری از نمونه را بپیماید. در نتیجه، هرچه زاویه چرخش بیشتر شود، کیفیت تصویر کاهش می‌یابد. در عمل، چرخش نمونه بیش از 60 تا 70 درجه تقریبا هیچ اطلاعات مفیدی به دست نمی‌دهد. به همین دلیل، تصویربرداری در زوایای بالاتر انجام نمی‌شود. این محدودیت باعث میشود بخشی از اطلاعات سه‌بعدی نمونه در بازه زوایای 70 تا 90 درجه ثبت نشود. این پدیده را "گوۀ گمشده اطلاعات" می‌نامند که باعث میشود وضوح تصویر نهایی در راستای موازی با پرتو الکترونی کاهش یابد.
این نمودار شماتیک، انتقال اطلاعات در طرح‌های مختلف شیب (کج کردن نمونه) را نشان می‌دهد. محور افقی: زاویه شیب از -60 درجه تا +60 درجه. محور عمودی: فرکانس فضایی (با مقیاس 1 بر نانومتر).
اصطلاح "گوه گمشده" از بررسی تبدیل فوریه توموگرام سرچشمه می‌گیرد. در این نمایش ریاضی، به دلیل چرخش نکردن نمونه تا زاویه 90 درجه، یک بخش خالی به شکل گوه آشکار میشود که کاهش وضوح در عمق نمونه و از دست رفتن اطلاعات محوری (به ویژه در راستای z) را در پی دارد. در روش‌های بلورنگاری، این مشکل معمولا با دو روش حل میشود:
ادغام چندین مجموعه داده که بر یکدیگر همپوشانی دارند.
توسعه تقارن در مواردی که ساختار متقارن باشد.
از آنجایی که هر دو این راه حل ها به دلیل ماهیت ذاتی بلورنگاری هستند، قابل اعمال در توموگرافی نمی‌باشند، چرا که در اغلب موارد در توموگرافی با نمونه‌های منحصر به فرد و فاقد آرایش متقارن و منظم سروکار داریم.
بخش بندی
یک چالش بزرگ در کرایوئی‌تی، شناسایی ساختارهای مورد نظر در محیط‌های سلولی پیچیده است. برای غلبه بر این مشکل، از روش‌های تلفیقی زیر استفاده میشود:
میکروسکوپ نوری کرایو-فلورسانس
میکروسکوپ نوری با وضوح فوق العاده (مانند کرایو-پالم[۱۷])
فرآیند کار با این دستگاه‌ها به این صورت است:
آماده سازی نمونه: نمونه‌ای که حاوی پروتئین مورد نظر نشان‌دارشده با فلورسانس است، به سرعت منجمد میشود.
تصویربرداری اولیه با میکروسکوپ نوری: نمونه منجمد شده ابتدا در یک میکروسکوپ نوری ویژه - که قابلیت نگهداری نمونه در دمای زیر -150 درجه سانتیگراد را دارد - تصویربرداری میشود. موقعیت سیگنال فلورسانس در این مرحله شناسایی میشود.
انتقال و تصویربرداری با وضوح بالا: نمونه به میکروسکوپ الکترونی کرایو منتقل شده و همان موقعیت دقیق با وضوح نانومتری توسط کرایوئی‌تی تصویربرداری میشود.
